蛋白质印迹法实验步骤

对于蛋白质印迹法，将膜与使用 5% w/v BSA 或脱脂奶粉的 1X TBS、0.1% Tween20稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜，同时轻轻振摇。

A. 溶液和试剂

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后将其混匀。

2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)： 要制备 1 L 1X TBS：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X，然后混匀。

3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack 或Red Loading Pack ；通过添加 1/10 体积的 30 X DTT 至 1 体积的 3 X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3 X 还原上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。

4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 电泳缓冲液，然后混匀。

5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：要制备 1 L 1X 转移缓冲液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 转移缓冲液，然后混匀。

6. 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：要制备 1 L 1X TBST：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混匀。

7. 脱脂奶粉

8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脱脂奶粉并充分混匀。

9. 洗涤缓冲液：1X TBST。

10. 牛血清白蛋白 (BSA)

11. 一抗稀释缓冲液：如一抗数据表上所示，含 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉并充分混匀。

12. 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：

13. 预染蛋白质标准品，宽范围 (11-190 kDa)

14. 印迹膜和纸：本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。

15. HRP 偶联二抗：抗兔 ,　抗小鼠

16. 检测试剂：LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 。

B. 蛋白质印迹

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。

3. 加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞（6 孔板每孔加 100 µl 或直径为 10 cm 盘中加 500 µl）。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。

6. 微量离心机内离心 5 分钟。

7. 取 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

   注：建议将预染蛋白分子量标准品（5 µl/泳道）上样以验证电转移和将生物素化的蛋白质分子量标准品 (0 µl/泳道）上样以确定分子量。

8. 电转至硝酸纤维素膜 。

   C. 膜封闭和抗体孵育

   
   

   I. 膜封闭

   1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。

   2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。

   3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   II.一抗孵育

   根据所使用的一抗，继续下述其中一项的具体步骤。

   对于无偶联的一抗

   1. 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

   2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   3. 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗，同时加入anti-biotin, HRP-linked Antibody以检测生物素化的蛋白质标准品。置于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。

   4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   5. 继续进行检测（D 部分）。

   对于偶联有HRP 的一抗

   1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

   2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   3. 与检测生物素酰化蛋白质标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody 在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻搅动。

   4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   5. 继续进行检测（D 部分）。

   对于生物素化的一抗

   1. 将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

   2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   3. 将膜与 Streptavidin-HRP 在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。

   4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

   5. 继续进行检测（D 部分）。

   请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

   D. 蛋白质检测

   1. 将膜与 10 ml LumiGLO®（0.5 ml 20X LumiGLO® 、0.5 ml 20X 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ （5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温下孵育1 分钟并不时轻轻搅动。

   2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

      注：由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的 2 小时内会减弱。